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【細(xì)胞傳代】

當(dāng)細(xì)胞匯合度達(dá)到80%-90%，即可傳代培養(yǎng)。

收集細(xì)胞：貼壁細(xì)胞可以參考以下方法1、吸去培養(yǎng)液，加入不含鈣鎂的PBS，輕輕潤(rùn)洗瓶底1-2次，吸棄PBS；2、加入0.25%胰酶-EDTA消化液（T25瓶1-2mL，T75瓶2-3mL），鋪勻瓶底放入培養(yǎng)箱中消化1-2min；（部分細(xì)胞貼壁較牢，可采用分步消化：將消化下來(lái)的細(xì)胞轉(zhuǎn)移至離心管終止，在培養(yǎng)瓶中加入胰酶繼續(xù)消化，直至大部分細(xì)胞脫落）3、倒置顯微鏡下觀(guān)察大部分細(xì)胞變圓脫落，迅速加入完全培養(yǎng)基終止消化，完培與胰酶比例為2:1；4、輕輕吹打細(xì)胞后吸出轉(zhuǎn)移至離心管中。半貼壁半懸浮細(xì)胞需先收集懸液至離心管再參考貼壁細(xì)胞操作。

離心：收集好的細(xì)胞在1000rpm條件下離心3~5min，離心好后棄除上清液。

接種：準(zhǔn)備好新的培養(yǎng)瓶并添加適量完全培養(yǎng)基，在離心管加入1-2mL完全培養(yǎng)基重懸吹打均勻，初次傳代將細(xì)胞懸液按1:2比例接種到新的培養(yǎng)瓶中，后續(xù)可根據(jù)細(xì)胞實(shí)際情況按1:2-1:4的比例傳代；接種完成后放入37℃、5%CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。

懸浮細(xì)胞建議采用半換液傳代：將培養(yǎng)瓶站立靜置5-10min，肉眼可見(jiàn)細(xì)胞沉底，吸取1/2~2/3上清至離心管離心，將瓶?jī)?nèi)剩余懸液按1:2或1:3的比例轉(zhuǎn)移至新的培養(yǎng)瓶，將離心管中的細(xì)胞重懸后放入培養(yǎng)瓶添加新鮮完全培養(yǎng)基即可。

【細(xì)胞凍存】

收集細(xì)胞參考細(xì)胞傳代步驟。

凍存液重懸：細(xì)胞按照傳代步驟收集細(xì)胞至離心管并計(jì)數(shù)，根據(jù)計(jì)數(shù)的密度決定細(xì)胞凍存數(shù)量，一般推薦細(xì)胞凍存密度為1×106-1×107個(gè)活細(xì)胞/管。離心后棄上清，加入配制好的凍存液重懸，分配到凍存管中，每管1mL。

凍存：將凍存管放入程序降溫盒中進(jìn)行梯度降溫，然后放入-80℃冰箱降溫，24h后將凍存管轉(zhuǎn)入液氮罐中。若沒(méi)有凍存盒，可于冰箱4℃放置30min，隨后轉(zhuǎn)移至-20℃冷凍2h，接下來(lái)將其放于-80℃超低溫冰箱中過(guò)夜，最終放置于液氮中以長(zhǎng)期保存。